Métodos para detecção – Cromatografia em Camada Delgada

Existem três tipos de métodos de detecção aplicáveis a Cromatografia em Camada Delgada (JORK, FUNK, et al., 1990):

a)    Métodos Físicos: São técnicas não-destrutivas. Incluem absorção fotométrica, inibição de fluorescência ou fosforescência e detecção de substâncias marcadas radioativamente;

b)    Reações Microquímicas: Uso de um reagente universal ou com substâncias que reagem com um grupo funcional específico.

c)    Detecção biológico-fisiológica (Biological-physiological detection): métodos que dependem da atividade biológica de componentes separados, independentemente de suas propriedades químicas ou físicas. São altamente específicos. Usados para detecção e determinação de antibióticos, alcalóides, inseticidas, fungicidas, micotoxinas, vitaminas e saponinas.

 

1 Luz Ultravioleta

O uso da luz ultravioleta é aplicável para fases estacionárias impregnadas com material fluorescente (placas F254). Usa-se o comprimento de onda de 254 nm e, se o analito absorve a luz, ele será visto como uma mancha preta, enquanto que o fundo estará colorido devido ao reagente fluorescente. Se o composto é naturalmente fluorescente, o uso do comprimento de onda de 365 nm pode ser usado (WATSON, 1999).

 

2 Tratamento com Iodo

O iodo atua como um reagente universal, visto que há exemplos de aplicação para várias classes de substâncias – ex.: aminoácidos, indóis, alcalóides, esteróides, psicotrópicos, lipídios. O cromatograma pode ser tratado com vapores de iodo (coloca-se a placa em uma câmara onde anteriormente cristais de iodo foram dispersos em seu fundo, esperando que esta fique saturada de vapores de iodo) ou pela nebulização de uma solução de iodo (JORK, FUNK, et al., 1990).

A reação com o iodo geralmente é reversível. Caso a opção seja vapores de iodo, deve-se documentar o cromatograma rapidamente, pois as manchas desaparecerão quando o vapor de iodo for evaporado da placa. No desejo de preservar as manchas, pode-se usar uma solução de amido, produzindo manchas azuis estáveis (JORK, FUNK, et al., 1990).

Os tipos de reações que poderão ocorrer com o iodo são (WALL, 2005):

a)    Formação de produtos de oxidação: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, indóis e derivados quinolínicos;

b)    Adição do iodo a ligações duplas: alcalóides derivados da quinina, barbitúricos, lipídeos insaturados, capsaicinóides e calciferol;

c)    Adição a nitrogênio terciário: opióides

d)    Adição a grupo –OCH3: brucina

e)    Oxidação de enxofre e adição a dupla ligação no anel tiazólico: tióis e tioéteres;

f)      Formação de complexo: alcalóides, fenotiazinas e sulfonamidas.

Um exemplo na farmacopéia brasileira é a identificação de Ampicilina, tanto na matéria-prima, como no produto terminado – cápsulas, comprimidos e pó para suspensão oral (Farmacopéia Brasileira, 2000).

 

3 Derivatização

Os métodos físicos de detecção não são suficientes para conferir um alto grau de precisão e acurácia (JORK, FUNK, et al., 1990). Assim, estes métodos podem ser complementados por reações químicas específicas (derivatização). A derivatização pode ocorrer em várias etapas:

a)    Anteriormente ao desenvolvimento cromatográfico (pré-cromatográfico): pode ser efetuada durante a preparação da amostra ou diretamente na placa;

b)    Posteriormente ao desenvolvimento cromatográfico (pós-cromatográfico): detecção do cromatograma em sua forma propriamente dita.

 

3.1 Reagente aldeído/ácido

Baseia-se numa reação que depende da protonação de um aldeído aromático (vanilina ou anisaldeído), que ocorre na presença de eletrófilos. A condensação com certas moléculas orgânicas pode ocorrer imediatamente para formar corantes do tipo trifenilmetano. A associação vanilina/ácido sulfúrico ou vanilina/ácido clorídrico pode ser usada para visualização de catequinas, alcalóides, flavonóides, componentes de óleos essenciais, esteróides e fenóis (WALL, 2005). Já a associação anisaldeído/ácido sulfúrico pode ser usada para visualizar antioxidantes, esteróides, prostaglandinas, carboidratos, fenóis, glicosídeos, parte aglicona de saponinas, componentes de óleos essenciais ou terpenos, antibióticos (macrolídeos e tetraciclinas) e micotoxinas – tricotecenos (JORK, FUNK, et al., 1990).

Na farmacopéia brasileira, encontramos exemplo deste reagente na monografia do cloridrato de propranolol – substâncias relacionadas (Farmacopéia Brasileira, 2001). O reagente é formado por anisaldeído, ácido acético glacial, metanol e ácido sulfúrico.

 

3.2 Reagente de Dragendorff

O Reagente de Dragendorff pode ser utilizado para visualizar a maioria, quem sabe até a totalidade, dos compostos orgânicos nitrogenados. Consiste na preparação de duas soluções (WALL, 2005):

a)    Solução A: Nitrato de Bismuto (III) é dissolvido em ácido acético e água

b)    Solução B: Iodeto de potássio é dissolvido em água

A partir da mistura de igual proporção destas soluções, prepara-se uma solução de estoque. A solução a ser borrifada é obtida pela mistura da solução de estoque com ácido acético e água.

A monografia de clotrimazol creme possui um teste de identificação que faz uso deste reagente, mas utilizando ácido clorídrico no lugar no ácido acético (The United States Pharmacopeia, 2006). As manchas do analito aparecem com coloração alaranjada.

 

3.3 Tratamento com ninidrina

Constitui um método de derivatização que pode ser tanto pré-cromatográfico, quanto pós-cromatográfico. A ninidrina pode ser colocada na fase móvel com o objetivo de converter peptídios, aminoácidos ou aminas para derivados fluorescentes ou coloridos (JORK, FUNK, et al., 1990). Aminas primárias geram manchas de cor rosa, enquanto que as terciárias produzem cor amarela (WATSON, 1999).

Existem exemplos do uso da ninidrina em farmacopéias. A identificação de cefalexina em suspensões orais, comprimidos e cápsulas pode ser feita inserindo a ninidrina na fase móvel (The United States Pharmacopeia, 2006). A ninidrina também pode ser usada em solução reveladora: a identificação de carbidopa+levodopa em comprimidos – solução de ninidrina em acetona (The United States Pharmacopeia, 2006) – e a identificação de amoxicilina em cápsulas – solução de ninidrina em etanol (Farmacopéia Brasileira, 2000).

 

3.4 Reagent de Ehrlich

Detecta aminas e indóis. É uma solução de 4-dimetilaminobenzaldeído em ácido clorídrico/etanol (WALL, 2005). As monografias de substâncias relacionadas de ibuprofeno (Farmacopéia Brasileira, 2001) e ensaio de pureza (limite de degradação de sulfametoxazol) apresentam esta solução reveladora (Farmacopéia Brasileira, 2003).

 

3.5 Cloreto Férrico

Detecta fenóis, alcalóides do ergot, ânions inorgânicos, enóis, ácidos hidroxâmicos e ésteres de colesterol. Dilui-se o cloreto férrico em etanol ou água. Após tratamento, a placa deve ir para estufa (WALL, 2005). Na farmacopéia brasileira, o teste de substâncias relacionadas do ibuprofeno faz uso deste reagente (Farmacopéia Brasileira, 2001).

 

3.6 Regente de Jenson

Usados para detectar glicosídeos cardíacos. Formado por mistura de Cloramina T com ácido tricloroacético em clorofórmio, metanol e água. Após tratamento, deve ir para estufa (WALL, 2005). A monografia da digoxina contempla o uso deste reagente (Farmacopéia Brasileira, 2002).

 

Referências

FARMACOPÉIA Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2000. pt. 2. n. 2.

FARMACOPÉIA Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2001. pt. 2. n. 3.

FARMACOPÉIA Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2002. pt. 2. n. 4.

FARMACOPÉIA Brasileira. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2003. pt. 2. n. 5.

JORK, H. et al. Thin-Layer Chromatography – Reagents and Detection Methods. Weinheim: Vch Verlagsgesellschaft Mbh, v. 1a, 1990.

THE United States Pharmacopeia. 30. ed. Rockville: The United States Pharmacopeial Convention, 2006.

WALL, P. E. Thin-layer Chromatography. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2005.

 

Sobre Campo de Arroz

Farmacêutico interessado em matemática, ciência e tecnologia.
Esta entrada foi publicada em Controle de Qualidade, Cromatografia em Camada Delgada, Farmacopéia Brasileira, Química Analítica. Adicione o link permanente aos seus favoritos.

Deixe uma resposta